常用的半抗原與蛋白偶聯方法簡介
———文章轉自zjubell， 發表在丁香園免疫學技術論壇。

（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶聯
1、混合酸酐法，也稱氯甲酸異丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶聯時，半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在有機溶劑中形成混合酸酐（mixed acid anhydride）,然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵。

氨甲喋呤（MIT）與β-半乳糖苷酶偶聯的混合酐法
1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷卻至10度，加2ul氯甲酸異丁酯，10度攪拌反應30分鐘。
2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反應4小時（必要時加NaOH,以維持溶液的pH為9.0，q然后4度過夜。
4、過sephadex G-25層析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸緩沖液（pH7.5）平衡和洗脫，合并含酶的洗脫管內液體，進一步純化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%（w/v）的緩沖液中。

2、碳化二亞胺法制備3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血藍蛋白免疫原的操作步驟
1、  取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）
2、  取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解（II液）
3、  取血藍蛋白（lemocyanin） 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）
4、  將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）
5、  室溫下避光攪拌1小時，逐滴加入余下的I液
6、  4度攪拌12小時
7、  靜置10小時（4度）
8、  有蒸餾水使之充分透析（約48小時），得免疫原。

3、孕酮與與β-半乳糖苷酶偶聯的N-羥琥珀酰亞胺酯法
1、  用二堊烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成濃度為100m mol/L的溶液。
2、  加羥琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide） 100 m mol/L 和 DCC（二環已基碳化二亞胺），200 m mol/L, 4度反應16小時。
3、  用簿層掃描方法純化（氯仿：水=9：1）
4、  按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例，將上述溶液加入到酶液（用pH7.4，濃度50 m mol/L的磷酸緩沖液溶解）中。
5、  
（二）含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯
1、芳香胺類半抗原與蛋白質重氮化偶聯的操作步驟
1、  用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L濃度的半抗原。
2、  滴加1％NaNO2（過量），4度持續攪拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物試紙或在白色磁磚上加1％淀粉和50m mol/L KI進行監控。游離HNO2可將氧化物氧化成碘，碘再與淀粉反應變成藍黑色。
3、  溶液變成藍黑色后，繼續反應15分鐘。
4、  用pH9.0、濃度為200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白。
5、  邊攪拌，邊加入重氮化的半抗原（防止局部發生酸過量現象），調節pH到9.5。
6、  冰箱中攪拌反應2小時，不斷調節pH到9.0。
7、  用PBS透析2天
8、  -20度保存（濃度為20mg/mL）

雙功能的酰亞胺酯（imidate esters）可以氨基反應，形成脒。例如：用二甲基已二酰亞胺酯（dimethyladipimide）將去甲基三正喋呤（desmethylmortriptyline）與β-半乳糖苷酶偶聯。
2、、應用雙功能酰亞胺酯（imidate esters）制備去甲基三正喋呤-與β-半乳糖苷酶標記特的操作步驟
1、  用含5％（W/V）N-乙基嗎啉的無水甲醇0.4ml,在室溫下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亞胺酯（dimethyladipimide）（A液）
2、  取與β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸緩沖液（含MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L 0.1ml（B液）
3、  將A液倒入B液。
4、  20度反應90分鐘后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸緩沖液（50m mol/L） 1ml, 終止反應。
5、  過sephadex G-25, 去除小分子物質，得酶標記物（約75％的酶與半抗原結合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤（demethylmortriptyline ）進行偶聯，則只有15％的酶與之結合。

（三）含巰基半抗原的偶聯
可用馬來酰亞胺方法與蛋白偶聯。此外，將載體蛋白用溴乙酰胺（bromoacetamide）激活。或將載體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過過氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質分子上。

（四）含羥基的半抗原偶聯
醇類羥基通過形成半琥珀酸酯轉化為羧基的操作步驟
1、  15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐（succinic anhydride）和8.7ml 三乙基胺（triethylamime）用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、  加熱回流1小時。
3、  減壓蒸餾去溶劑，,殘余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、  用Ether洗滌兩次，然后用H2SO4進行s酸化（pH到2.0）.
5、  用水洗滌固形物（為三氯乙基半琥珀酸酯）兩次，用氯仿-已烷使其結晶（產量約75％，熔點88-89度）
6、  取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亞硫酰氯（thionyl chloride）中，65度加熱30分鐘。
7、  減壓蒸發，干燥1小時（高度真空條件下）。
8、  將上述產生（2，2，2-三氯憶基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺（N,N-dimethylethylacetamide）中，室溫攪拌反應2小時。
9、  65度真空蒸發后，用異丙醇使結晶析出來（得鹽酸化的結晶---5`-酯約84％，熔點160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，這樣引和的羧基可與蛋白質偶聯（如用碳化二亞胺化）。

半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再與蛋白質偶聯的操作步驟
1、  20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反應30分鐘。
2、  加1滴乙二醇（得A液）
3、  將A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3調節pH至9.0）中
4、  4度反應2小時，期間不斷調節pH9.0
5、  加入臨時配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量為反應體積的1/10。 4度反應過夜。
6、  用含有MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）透析（更換透析液數次）

（五）含酮基或酮基半抗原的偶聯
是將酮基經羥胺類化合物處理變成肟類化合物，再進一步將肟類化合物中的羥基，衍變成羧基化合物，再進一步進行含羧基半抗原的偶聯操作。這類羥胺類化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者鹽酸羥胺
酮基的類固醇分子中引入羧基的操作步驟
1、  在200ml 乙醇中，加入O-（羧甲基）羥胺 （O-（carboxyl）hydroxylamine）和酮基半抗原，使其濃度分別為10m mol/L 和4m mol/L
2、  加熱回流90分鐘
3、  旋轉蒸發，減少容積，然后加水至40ml，用ether抽提
4、  用水洗滌ether抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。

（六）、其他半抗原的偶聯
雖含有游離基團，但因這些基團對于維其生物活性十分重要，因些不能直接用來與載體蛋白 偶聯。
制備雌二醇-6-肟的操作步驟
a、  雌二醇二醋酸鹽的制備
1、  1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、  加熱回流1小時，冷卻后傾入冰水中。
3、  收集白色晶體，得產物約1.1g（熔點126到127度）
b、  雌二醇-6-酮-二醋酸鹽的制備
4、雌二醇二醋酸鹽1.1g，滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml （H2O:Hac=0.75:5.6）
5、室溫攪拌1小時，靜置24小時
6、用水稀釋，用ether提取4次
7、用蒸餾水洗2次
8、減壓蒸餾，得結晶油狀渣物。
9、用90度烘干20分鐘，得粗制品約500mg
10、用11ml 無水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉納你特T試劑（Girad T），回流1小時。
11、冷卻后，用冰致冷的蒸餾水稀釋，用2.5mol/LNaOH調節pH至6.0-6.2.
12、用ether抽提3次，棄去ether。
13、水層用濃鹽酸酸化（鹽酸終濃度為1mol/L）.
14、室溫靜置2小時。
15、用ether抽提3次。
16、合并ether抽提液，用0.125mol/L碳酸鈉溶液洗1次，用蒸餾水洗3次。
17、用無水硫酸鈉脫水，蒸干。
18、加7ml 醋酐，回流20分鐘。
19、冷卻后傾入用冰致冷的蒸餾水中，然后過濾、干燥得產物約176mg （熔點為162-166度）
c、  二醇-6-酮的制備
20、用5.5ml 20％的氫氧化鉀-甲醇溶液（W/V）溶解雌二醇-6-酮-二醋酸鹽（176mg）,在室溫下于氮氣中水解24小時。
21、加蒸餾水稀釋，用ether抽提3次。
22、在ether提取液中無水硫酸鈉進行脫水，蒸發干燥，得產物約60mg（熔點為278-282度）
d、  雌二醇-6-肟的制備
23、取雌二醇-6-酮 50mg ,鹽酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇（V/V）7ml 和1mol/L醋酸鈉4ml中，回流1.5小時。
24、減壓、蒸餾、濃縮后，加蒸餾水20ml
25、用2 mol/L NaOH調節pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水層用1 mol/L鹽酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液，蒸干，得產物約100mg（結晶熔點約186-188度）

其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、熒光素等半抗原交聯。